菌种保藏是保持微生物菌株活力和遗传性状稳定的一项基础技术。微生物在培养、使用和传代过程中，容易发生污染、变异甚至死亡，进而导致菌种衰退。菌种保藏的目的，就是使菌株存活、不丢失、不污染杂菌、不发生或少发生变异，并尽可能保持菌种原有的活性和各种特征。

菌种保藏的基本原理，是通过人工创造适宜条件，使微生物的生命活动处于半永久性的休眠状态，将新陈代谢限制在最低范围内。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件均可抑制微生物代谢，因此也是菌种保藏的重要手段。选择保藏方法时，首先应考虑该方法能否长期保持菌种原有特性，同时兼顾经济性和操作简便性。实际工作中，往往多种条件同时使用，以提高保藏效果。

一、菌种保藏的一般步骤

无论采用哪种保藏方法，菌种保藏通常遵循以下基本流程：

1.挑选特征典型的纯菌菌落，确保起始菌株的纯度与代表性；

2.确定保藏的合适菌体形态，如营养体、芽孢、孢子等；

3.选择最适宜的保藏方法，结合菌种特性与使用需求综合判断；

4.定期对保藏菌种进行检查，观察其是否发生变化；若发现性状改变，须及时调整保藏方法；

5.保藏期满应及时进行移种，避免菌种因超期保存而丧失活力。

二、常见保藏方法详解

2.1/甘油保菌法

甘油保菌法适用于菌种的中长期保藏，是目前使用较为广泛的长期保藏法之一。其优点是操作简单、保藏期长，且菌种不容易发生变异。该方法适用于各类微生物，保藏时间可达1年以上。

操作要点：

・由于甘油本身十分粘稠，难以定量，一般将甘油和生理盐水按1:1的比例配成终浓度为50%的甘油溶液；

・使用时，按50%甘油：菌液 = 1:1的比例混合，使甘油终浓度控制在20-30%。甘油浓度过高或过低都不利于菌种保藏；

・将甘油菌种转移至-60~-80℃冰箱长期冻存；

・取用菌种时，将冻存管置于37℃水浴中快速解冻，直到菌种完全融化后取出进行实验，切勿常温缓慢融化；

・特别注意：不要对菌种进行反复冻融，否则容易导致菌体死亡。

图1 用甘油冻存菌种

Tips： 菌种是生产活动的起始原料，是一种重要的资源。菌种库需选择合适的保藏方法，并置于合适的环境，以维持菌种的特性稳定。耀海生物可以满足大肠杆菌的甘油管保藏（超低温冰箱或液氮）以及冻干保藏的需求。（如需菌种建库及相关服务，请随时联系菌菌 199 5298 1076）

2.2/斜面保菌法

斜面保藏是目前最普遍的短期保藏法，操作简单、使用方便，不需要额外的特殊设备。但其缺点也较为明显：需定期接种转接，工作量较大；传代次数多、易发生变异；且污染杂菌的机会较高。因此，斜面保菌法仅适用于短期经常使用的菌种。

操作要点：

1.将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后转移至4℃冰箱中保藏；

2.保藏时间因微生物种类而异：一般大肠杆菌每一个月需移种一次，酵母菌为2个月；

3.取用菌种时，用接种环在斜面上挑取少量菌体进行接种即可。

注意事项：

1.斜面装液量以倾斜后不超过试管长度的1/2为宜；

2.培养温度应较最适温度稍低，培养时间应较最适时间略长；

3.保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。

图2 斜面保藏菌种

表1 斜面保菌法的基本要求

2.3/穿刺保菌法

穿刺保菌法与斜面保菌法一样，均为常用的短期保藏方法，多用于传代培养中，因此同样需要定期移种。

操作要点：

・准备一管半固体培养基；

・用接种针挑取菌种，自半固体培养基的中心垂直刺入，直至接近试管底部，但不要穿透；

・然后沿原穿刺线将接种针退出；

・于4℃冰箱保存即可。

2.4/液体石蜡覆盖保藏法

液体石蜡覆盖保藏法是斜面保菌的辅助方法。

操作要点：

・将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，注入无菌液体石蜡，使其完全覆盖整个斜面；

・直立放置于4℃冰箱中保藏。

原理： 液体石蜡一方面可防止因培养基水分蒸发而引起的菌种死亡；另一方面可以使菌体与空气隔绝，减弱菌种的代谢作用，从而延长保藏时间。

优缺点：

・优点：操作简单，不需要特殊设备，且不需要频繁移种，保藏时间较长；

・缺点：保存时必须直立放置，占用空间较大。

取用菌种时，用接种环从斜面上挑取少量菌种即可。

表2 液体石蜡保藏对不同菌种的保藏效果

2.5/沙土保藏法

沙土保藏法是典型的载体保藏法，即将菌种吸附在载体沙子上然后进行干燥的保藏方法，使用相当广泛。

操作要点：

・将培养好的菌种与无菌沙土混合，使菌体吸附在沙土载体上；

・干燥后转移至4℃冰箱保存；

・取用菌种时，取出少量沙土颗粒即可。

保藏效果： 大肠杆菌、酵母菌均可用此法保藏2年左右。此法较液氮保藏、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备，且保藏时间长，是一种性价比较高的中长期保藏方案。

2.6/冷冻干燥法

冷冻干燥法的原理是：先使微生物处在极低温度（约-70℃）下快速冷冻，然后在减压条件下利用升华现象除去水分，其中以真空冷冻干燥法最为常见。菌种在升华过程中水分被去除，细胞的生理活动趋于停止，从而使菌种长期维持存活状态。

使用方式： 需要取用菌种时，用无菌水或培养基重悬菌体，将菌悬液转移至固体培养基平板上进行培养即可。

优缺点： 此方法适用于菌体的长期保存，保藏效果优异；但所需的相关设备和操作相对其他几种保藏方法都比较复杂，对硬件条件要求较高。

三、菌种保藏的关键影响因素

3.1/菌的质量

菌种本身的质量是保藏成败的关键影响因素。用于保藏的菌种应培养在营养丰富的条件下，使之进入稳定期——稍老一些的菌体对环境的抵抗力更强。此外，作为冷冻干燥用的菌悬液，细胞浓度要高。不同的菌对冷冻干燥的耐受程度不同，如果保存的菌液细胞浓度不高，就会给以后的传种造成困难，保存期也会受到影响。

3.2/保护剂

不同种类的保护剂对不同菌种的作用差异很大。例如，个别菌种在以脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达99.99%，而采用葡聚糖等混合保护剂时，死亡率可大大降低。一般情况下，不易保存的菌种对保护剂的要求较高。因此，选择合适的保护剂是冷冻干燥保存菌种的关键因素。

3.3/其他理化因素

空气、温度、含水量等理化因素对菌种保藏同样极为关键：

1.空气： 冷冻干燥后，空气对细菌细胞影响较大，可导致细胞损伤进而死亡。故冻干后应立即在真空下融封，才有利于长期保存；

2.温度： 在干燥和真空状况下，温度的影响并不大，因此可以室温保存；但许多微生物在4℃保存的存活率要比在室温下高1倍，仍建议低温保存；

3.水分含量： 水分含量过高对菌体存活不利，但完全脱水也不利于保存。一般将干燥后细胞的含水量控制在3%以下。

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四、结语

本期菌周刊，我们系统梳理了菌种保藏的基本原理、一般步骤，详细介绍了6种常见菌种保藏方法（甘油保菌法、斜面保菌法、穿刺保菌法、液体石蜡覆盖保藏法、沙土保藏法、冷冻干燥法）的操作要点与优缺点，并总结了菌种保藏过程中的关键影响因素。

在实际工作中，没有一种方法是万能的，应根据菌种的种类特性、使用频率、保藏期限以及实验室条件，综合选择最合适的保藏策略，必要时可多种方法配合使用，最大程度地保障菌种的活性与遗传稳定性。