代谢工程是合成生物学的重要分支，经过三十余年发展，已从早期依赖经验性改造，逐步走向理性设计与系统优化。早期策略主要包括删除副产物分支、解除反馈抑制、增强关键酶表达等；如今则融合了代谢数据库、网络模型计算、途径组装和动态调控等技术，使细胞代谢网络改造更加精准高效。
在众多底盘微生物中，大肠杆菌优势突出：遗传背景清楚、生长较快、培养基要求简单，并能利用葡萄糖、木糖、甘油等多种底物，因此成为代谢工程中应用最广的模式菌株之一。经改造后，大肠杆菌可生产有机醇、氨基酸、有机酸、有机胺、维生素、天然产物及聚羟基脂肪酸酯（PHA）等，并在L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、1,3-丙二醇、D-乳酸、丁二酸、戊二胺等大宗化学品的绿色生物合成中展现出潜力。
大肠杆菌代谢工程30年发展途径
大肠杆菌代谢工程技术
一、大肠杆菌代谢途径设计
根据途径来源，大肠杆菌代谢途径设计大致可分为三类。
1.1/完全依赖大肠杆菌自身代谢网络
丁二酸、丙酮酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸等产物的合成路线，本身存在于大肠杆菌天然代谢体系中。改造重点是对这些天然途径进行精细调节，例如解除关键节点反馈抑制、提高限速酶表达水平、维持辅因子代谢平衡，从而将代谢流最大限度地导向目标产物。
1.2/引入异源代谢途径
大肠杆菌自身基因资源有限，常需借助外源基因补全途径或提升原有路线效率。例如，在生产1,3-丙二醇的细胞工厂中，可引入酿酒酵母的甘油-3-磷酸脱氢酶和甘油-3-磷酸酶，以及肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶；生产L-丙氨酸时，可导入嗜热脂肪地芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶；生产1,4-丁二醇时，则整合了来自5个不同来源的外源基因。
1.3/构建自然界不存在的合成途径
随着蛋白质理性改造和从头设计技术的发展，代谢途径设计已不再局限于天然路线，逐步发展出非天然合成途径，为新型生物制造拓展了空间。
二、合成途径的创建与优化
2.1/DNA片段组装
DNA片段组装是创建大肠杆菌代谢途径的重要前提。传统方法依靠限制性内切酶和DNA连接酶，但容易在接头留下酶切位点“疤痕”，且待组装片段内部不能含相应位点，可选酶种受限。
・Golden Gate组装：利用IIS类限制性内切酶识别位点与切割位点不一致的特性，在识别序列之外切割DNA。产生的粘性末端可在连接酶作用下按顺序连接，实现多片段无缝组装，最终产物不含酶切位点。
・Gibson组装：无需限制性内切酶，要求各DNA片段末端具有15—20 bp同源序列。DNA 5′核酸外切酶先切出粘性末端，同源区互补配对后，由DNA聚合酶补齐缺失碱基，DNA连接酶封闭切口。该方法可将一个或多个片段按预定方向快速、高效、精确地插入线性化载体，实现无缝组装。
・CPEC技术：即环形聚合酶延伸克隆，片段要求与Gibson类似，末端含同源序列。通过PCR实现：片段与载体变性解链，退火时同源末端互补，互为模板和引物，在聚合酶作用下延伸成带缺口的环状DNA，再在大肠杆菌中修复为完整质粒。CPEC简单、高效、经济，应用较广，但高GC含量片段组装效果不佳。
2.2/基因组编辑
要在基因组上建立稳定代谢途径，需插入外源基因、敲除内源基因并调控关键基因表达。同源重组是基础，其中Red系统应用最广。它来自噬菌体，依赖Exo、Beta、Gam三种蛋白协同完成同源重组，同源臂可短至50 bp，效率高且操作简便。基于Red系统，研究者建立了多种无抗性编辑策略：
1.Flp/FRT两步同源重组：Flp重组酶识别FRT位点，切除两位点间序列。先通过Red将两端带FRT的抗性基因整合到目标位点，再用Flp删除抗性基因。缺点是会残留FRT序列，不属于无痕编辑，多轮操作后可能降低编辑效率。
2.sacB两步正负筛选：sacB编码分泌性蔗糖果聚糖酶，可将蔗糖水解为葡萄糖和果糖，并把果糖聚合为高分子量果聚糖，对大肠杆菌有致死作用，因此是负筛选标记。先用Red整合带抗性基因和sacB的片段，再用靶片段替换；在含蔗糖培养基中反向筛选，获得抗性基因和sacB均被替换的正确转化子。
3.CRISPR/Cas9一步同源重组：Cas9在gRNA引导下切割靶位点，造成双链断裂并致死。Red系统可将供体片段导入靶位点修复断裂，或在Cas9切割前完成同源重组，使靶位点丢失而避免被切割。
2.3/基因表达调控
表达调控是代谢途径优化的核心。途径建成后，需要调节关键节点表达强度：增强产物合成和辅因子供给，弱化那些敲除后影响生长、但保留又不利于生产的基因。按层次可分为单基因、多基因和动态调控。
・单基因调控：针对染色体上某一特定基因。早期常用IPTG诱导型Tac、T7等强启动子，但强表达未必最优，可能造成代谢负荷。Lu等构建启动子文库，以不同强度启动子调控葡萄糖转运蛋白基因galP和葡萄糖激酶基因glk，组合菌株GalP93-Glk37显著提高葡萄糖消耗速率。利用RBS文库调控丁二酸转运蛋白DcuB和DcuC，也可增强丁二酸外排和产量。
・多基因调控：单基因操作维度有限，组合文库容量小，难以找到多基因最优搭配。Keasling团队开发可调控基因间区域（TIGRs）文库，利用基因间序列变化影响表达强度，在单一操纵子内同时调节多个基因。该策略用于大肠杆菌甲羟戊酸途径，使多个基因协同表达，甲羟戊酸产量提高7倍。Isaacs等开发多重自动基因组编辑（MAGE），借助Red系统和自动化循环设备对多个位点反复编辑，提高效率。基于CRISPR/Cas9，对染色体上木糖代谢途径3个基因进行文库调控，筛选到的最优菌株木糖代谢速率提高3倍。
・动态调控：这是代谢途径优化中最有效策略之一。静态调控易操作且效果明显，但细胞内代谢物不断变化，表达过高浪费资源，过低限制通路，最终因代谢失衡限制产率和产量。动态调控能实时响应代谢信号并反馈调节，更好适应胞内代谢和环境变化。
三、总结
大肠杆菌遗传背景清晰，代谢元件库丰富，基因组编辑技术完备，是代谢工程改造中最适合的底盘菌株之一。近年来，大肠杆菌在CO₂固定和甲醇利用方面取得新进展，经改造的菌株甚至能以甲醇为唯一碳源生长，为碳循环利用提供了新路径。随着人工智能和工程化理性设计的发展，结合日益丰富先进的生物技术，大肠杆菌代谢工程将朝着理性化、工程化、智能化的方向持续演进。
