自19世纪末抗体被发现以来，人类对这一免疫分子的探索从未停歇。传统IgG抗体由两条重链和两条轻链构成Y字形结构，虽然具备优异的特异性和亲和力，但体积较大、结构复杂的先天特征，使其在某些应用场景中受到限制。1989年，布鲁塞尔自由大学的Raymond Hamers教授在研究感染锥虫的骆驼时，意外发现了一类不含轻链、仅由两条重链构成的重链抗体（HCAb），其重链上的独特可变抗原结合结构域，正是后来被命名为纳米抗体（Nanobodies, Nbs）的分子基础。这一发现开创了抗体研究的新纪元。凭借小体积、高稳定性与强穿透力，纳米抗体正在肿瘤诊疗、药物递送、自身免疫疾病等领域掀起深刻变革，成为精准医学发展的关键推动力。
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一、分子结构：小而精的"单域奇迹"
传统IgG抗体每条重链含一个可变区（VH）和三个恒定区（CH1、CH2、CH3），每条轻链含一个可变区（VL）和一个恒定区（CL），通过二硫键连接形成Y字形结构。相比之下，纳米抗体缺失了CH1结构域和轻链，分子量显著降低，但依然保留了完整的抗原结合能力。
从结构上看，Nbs由四个骨架区（Framework Regions, FR）和三个互补决定区（Complementarity-determining Regions, CDR）组成。仅凭三个CDRs即可有效结合抗原，这一特性得益于CDR1的结构变异和CDR3的长度增加——CDR3区形成一个大的暴露凸环，与传统抗体的凹形或平形结合位点截然不同，因此能够触及传统抗体难以企及的抗原凹陷表位。此外，FR2区富含亲水氨基酸，赋予了Nbs优异的水溶性和稳定性。
图1 IgG抗体、HCAb和Nbs的结构差异
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二、优势与局限：硬币的两面
纳米抗体相较传统单克隆抗体展现出多重优势：
・体积小、穿透力强：可穿越传统抗体难以到达的肿瘤组织与生物屏障，尤其是血脑屏障；
・免疫原性低：分子量小降低了副作用风险；
・结合表位独特：CDR3凸形结构使其能结合抗原凹陷部位；
・稳定性优异：耐受高温与极端pH，便于长期储存和运输；
・生产简便：可在原核或真核系统表达，易于大规模工业化生产，成本显著降低。
但其局限性同样不容忽视：单价形式需改造为多价以增强治疗与诊断能力，增加了生产复杂性；体积小导致血清中易被肾脏清除、半衰期短；缺乏Fc区，无法发挥补体和ADCC等效应功能；此外，Nbs多为骆驼源，在人体内的免疫原性风险仍需进一步评估。
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三、纳米抗体的产生与生产：从基因到蛋白
3.1三大文库来源
Nbs主要可从三种文库中筛选获得：
免疫文库通过对羊驼或单峰骆驼进行目标抗原免疫（通常两个月内多次免疫）获得，随后从血液中纯化淋巴细胞、提取mRNA、逆转录为cDNA，经两步PCR扩增筛选目标Nbs序列，克隆至大肠杆菌等表达系统。这一策略依托动物完整的免疫应答，易获得高亲和力抗体。
天然抗体文库无需免疫步骤，直接从未免疫的多个动物采血建库；合成抗体文库则进一步绕开动物环节，可针对非免疫原性或毒性抗原生成Nbs，同时规避骆驼免疫相关的伦理问题。
图2 生成抗原特异性Nbs的方法
3.2筛选与亲和力鉴定
纳米抗体库的筛选与鉴定通常经历噬菌体展示、固相筛选、验证和亲和力评估等环节：利用M13噬菌体感染纳米抗体文库细胞，获得大量展示Nbs的噬菌体；与固定有目标抗原的微滴板共孵育后，通过pH冲击等方式洗脱阳性结合物；多轮筛选后转染至大肠杆菌扩增，再以ELISA验证特异性结合；对阳性克隆测序确定核苷酸序列；最后采用表面等离子体共振（SPR）技术筛选亲和力最高的候选序列，并以甘油菌形式保藏。
除M13噬菌体展示外，核糖体展示、细菌展示和酵母展示等替代系统也可避免噬菌体对微孔板的"粘附"问题，提高筛选准确性与效率。
3.3表达与纯化
Nbs的标准生产通常采用大肠杆菌表达系统：将含Nbs的大肠杆菌甘油菌接种至LB培养基过夜培养，转至TB培养基扩大培养；当培养物光密度（OD）达0.6–0.8时，添加1 mM IPTG诱导表达并过夜培养；离心收集细胞、缓冲液渗透裂解后再次离心取上清；纯化阶段采用固定化金属离子亲和层析（IMAC）靶向Nbs序列上的his6标签；最终通过SDS-PAGE、western blotting和差示扫描荧光法等方法进行蛋白验证与质量控制。
图3 Nbs的表达和纯化过程
值得关注的是，耀海生物作为国内微生物表达体系CRDMO领域的先行者，构建了覆盖纳米抗体从基因合成→菌株构建→小试表达→工艺开发→中试放大→GMP生产→质量研究→注册申报的完整服务链条。其核心优势在于同时掌握E.coli原核表达与毕赤酵母真核表达两大技术平台：E.coli系统拥有20+纳米抗体成功表达经验，可根据分子特性选择胞质或周质空间表达方案，快速获得可溶性目的蛋白；毕赤酵母平台通过高密度发酵实现10 g/L以上的表达量，支持PAOX1甲醇诱导型与PGAP组成型两种表达系统灵活切换，并具备糖基化修饰能力，更接近天然蛋白特性。
在规模化生产方面，耀海生物配备了50L-2000L全梯度发酵产能，上游5条独立原液生产线总产能达7500L，下游5条纯化生产线配备低、中、高压层析系统及超滤系统，覆盖澄清、捕获、精制全流程，可高质量满足从临床诊断到治疗需求的纳米抗体生产。
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四、诊断应用：多维度赋能精准检测
4.1免疫测定
Nbs凭借对目标抗原的高度特异性与亲和力，以及优于传统抗体的稳定性，被广泛应用于侧流免疫层析技术（LFIA），显著提升了检测准确性与可靠性，同时满足ASSURED标准（廉价、灵敏、特异、易用、快速、无设备）的全部要求。基于Nbs的夹心式LFIA已成功用于激酶、病毒及小分子的检测；夹心式ELISA则用于癌症生物标志物、环境和食品毒素以及食源性致病菌的检测。
4.2生物传感器
小尺寸、高稳定性、强抗原亲和力使Nbs成为生物传感器开发的理想元件，可耐受不理想的储存环境。纳米抗体生物传感器已用于检测心血管疾病标志物纤维蛋白原（检出限低且功能验证），并被开发用于SARS-CoV-2和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）刺突蛋白检测，在COVID-19疫情应对中展现出实战潜力。
4.3体内诊断
纳米抗体体积小、穿透力强、易于修饰、血液清除快，使其成为荧光或放射性靶向探针的理想载体。光学成像利用荧光标记，成本较低且无电离辐射；核成像（PET/SPECT）具备高穿透与定量能力。Nbs在这两类成像中均表现出高对比度、低辐射负担的特点，在多种癌症及其他疾病检测中前景广阔。
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五、治疗应用：从血液病到实体瘤
5.1癌症治疗
Nbs优异的肿瘤穿透能力和精准识别能力使其在肿瘤治疗中表现亮眼。一是开发表达靶向肿瘤抗原Nbs的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T），重新输注至患者体内以杀伤肿瘤细胞——相关产品已获FDA批准用于多发性骨髓瘤治疗；二是利用多价纳米抗体直接诱导肿瘤细胞程序性死亡；此外，Nbs在免疫检查点阻断、毒素偶联以及放射性核素治疗等领域也展现出广泛应用潜力。
5.2自身免疫性疾病
纳米抗体药物在这一领域率先实现商业化突破：Caplacizumab于2018年获欧盟批准、2019年获FDA批准，用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜zhihuiya.com；Ozoralizumab则获批用于类风湿关节炎。此外，Vobarilizumab、Sonelokimab、Gefurulimab等候选药物分别针对类风湿关节炎、银屑病、重症肌无力等适应症，正处于不同临床阶段。
表1 部分纳米抗体药物
5.3传染病
相较其他领域，治疗性纳米抗体在传染病方向的进展相对滞后。已有针对轮状病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）的纳米抗体，但前者自2013年后更新停滞，后者在二期试验中疗效不显著。尽管如此，Nbs在应对SARS-CoV-2、H7N9流感病毒及细菌毒素等方面仍显示潜力，在抗锥虫、疟原虫等寄生虫感染方向亦取得初步疗效。
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六、结语
纳米抗体以其独特的结构和卓越的性能，在疾病治疗、诊断以及肿瘤靶向诊断和治疗等方面展现出巨大潜力。其小巧的体积、高稳定性及强大的组织穿透能力，使其在众多生物疗法中脱颖而出。Caplacizumab和Ozoralizumab的成功上市，验证了纳米抗体技术的可行性和有效性。
随着微生物表达体系的持续成熟——以耀海生物为代表的双表达平台已能实现从基因序列到GMP成品的全流程交付，涵盖一价、二价、三价等多种纳米抗体构型——纳米抗体的制备工艺将更加完善，应用场景也将进一步拓展，为精准医学的发展注入新的动力。
