质粒DNA（pDNA）是基因治疗与DNA疫苗领域最成熟的载体形式。它的优势很直接：稳定、易于生产、储存和运输，因而在相当长的时间里替代蛋白质，成为基因递送的主力。但pDNA携带的细菌骨架序列——抗生素耐药基因、复制起点等——在人体内既无治疗价值，又可能带来免疫刺激和监管层面的额外负担。过去二十余年，DNA载体技术的核心命题之一，就是在“保留表达功能”与“剥离冗余序列”之间寻找更优解。
由此，三类新型DNA先后进入视野：Minicircle DNA（mcDNA）、Doggybone DNA（dbDNA）和Close-Ended DNA（ceDNA）。它们共享一个底层逻辑：让DNA分子更小、更“干净”、更稳定。
01
一、新型DNA：突破传统质粒的"天花板"
1.1
mcDNA——剔除细菌骨架的"瘦身版"质粒
mcDNA（Minicircle DNA）于1997年首次通过亲本质粒的重组过程获得。亲本质粒是目的基因克隆到的载体，在制备mcDNA时，其细菌骨架被去除，仅保留环形表达元件。常用酶介导体系包括Cre酶、Flp重组酶、λ整合酶以及φC31整合酶，其中φC31整合酶法的应用与研究最为广泛。
2003年，Chen团队改进了该方法，将I-SceI核酸内切酶基因与识别位点加入亲本质粒，用于去除产物中残留的细菌序列污染与PP；同时增加φC31整合酶基因拷贝数，提升重组效率。2010年，Chen团队进一步将I-SceI与φC31整合酶基因整合至大肠杆菌BW27783基因组，得到可快速制备mcDNA的工程菌株ZYCY10P3ST2——它至今仍是制备mcDNA最实用的菌株。
图1. mcDNA，一种新型非病毒载体
由于骨架中缺乏细菌序列，mcDNA在扩散与生物活性上明显优于pDNA。pDNA的核递送是关键限速步骤，其固有大小是进入细胞核的主要决定因素，而mcDNA在这方面表现出显著优势：在小鼠肺组织研究中，mcDNA治疗组的Luc活性水平高出6.5倍且表达时间更长；在GFP报告基因评估中，mcDNA的表达同样优于pDNA。综合现有数据，mcDNA通过增强并延长转基因表达，展现出优于pDNA的治疗潜力。
1.2
dbDNA——共价闭端、核酸酶抗性的"哑铃形"载体
pDNA优化的关键之一是消除细菌序列的影响并防止降解，而dbDNA（Doggybone DNA）目前几乎可以同时解决这两大痛点。dbDNA是一种封闭的双链构型，形似哑铃，相当于一个两端带有小单链环的线性质粒，具有三大优势：
1.序列与mcDNA相似，不含细菌序列和抗生素耐药基因，未转录的冗余序列也可被去除，带来更高的转录表达与安全性；
2.较小的尺寸可促进细胞与核递送，目前尚无关于载体大小的明确上限或下限报道；
3.结构不含暴露末端，具备完全的核酸酶抗性，稳定性甚至高于质粒和化学修饰的RNA，还可实现偶联以进行免疫激活和靶向递送。
2001年，Witting团队开发了名为MIDGE的新型最小尺寸载体，仅保留基因表达的必需元件（启动子、编码基因、RNA稳定序列），省略了大量非必要序列，是为转基因表达而设计的初始dbDNA。制备过程为：用限制性内切酶切割质粒中的表达元件，将含茎环结构的寡核苷酸连接到展示表达元件的双链DNA上，形成可避免核酸外切酶裂解的共价闭端结构；在T7 DNA聚合酶存在下，剩余质粒骨架序列被降解，简单纯化后即得MIDGE载体。Schakowski等比较了MIDGE与常规质粒在相同浓度下的体外EGFP表达，发现EGFP-MIDGE转染细胞中的蛋白表达更高，证实了其强大的基因转染能力。
图2. dbDNA的开发
为创新传统质粒制造，Touchlight于2010年引入了体外酶合成法。该系统使用高度特异性的原核端粒酶TelN识别56 bp的回文序列telO，在其末端形成共价闭合的发夹结构telR与telL，产生形似狗骨的迷你载体。这一体外DNA酶合成体系避免了许多不可控风险，前景广阔。已报道dbDNA表达的抗原水平与常规质粒相当，并在小鼠中提供针对病毒感染的有效保护。Touchlight还通过滚环扩增技术提升工艺产量，相比传统质粒生产，该工艺更可控、更简洁，使dbDNA生产可相对快速、轻松地实现全球技术转移。
1.3
ceDNA——容量三倍于AAV的"线性游离体"
ceDNA（Close-Ended DNA）由美国国立卫生研究院研究员研发，是一种工程化、双链、线性、共价闭端的DNA构建体，包含目的基因及其他表达调控元件。与腺相关病毒（AAV）载体类似，ceDNA两侧同样是两个倒置末端重复序列（ITR）。但相比容量有限的AAV，ceDNA可容纳上千碱基的构建体，几乎是AAV的3倍，为治疗由大基因引起的疾病创造了机会。ceDNA的ITR结构是进入细胞核的关键，其表达与非整合游离体一致。
就制备而言，Generation Bio已开发出快速酶合成（Rapid Enzymatic Synthesis, RES）方法，仅需1天即可生产高纯度ceDNA，具备极高的规模与成本效益。目前ceDNA的基因治疗研究主要集中在罕见病、疫苗和肿瘤学领域。此前，mRNA领域的龙头企业Moderna宣布与Generation Bio基于独家细胞靶向脂质纳米颗粒递送系统合作，开发非病毒核酸药物。
图3. ceDNA的结构与制造流程
02
二、DNA的优化：让表达"更上一层楼"
2.1
序列优化
除结构优化外，pDNA的内在成分同样需要精心打磨，以增强转基因表达。被广泛使用的DNA载体通常包含真核启动子、治疗基因的转录单元，以及扩增所需的细菌骨架。
骨架优化：在不改变整体结构的情况下，可对细菌骨架部分进行精简。例如将氨苄青霉素选择标记替换为卡那霉素选择标记，将pcDNA3.1修饰为pVAX1载体——因为氨苄青霉素存在引发自身免疫的潜在风险。此外，通过蔗糖选择系统替代传统选择标记也是可行路径；在CMV启动子5′-末端掺入72 bp的SV40增强子，并利用HTLV-I R区域在CMV启动子3′-末端提升染色体外转基因表达，可进一步提高翻译效率。
转录单元优化：非病毒载体应具备在细胞中高效表达的强启动子。基因表达通常由II型聚合酶启动子驱动，但其活性弱于病毒衍生启动子，例如巨细胞病毒或SV40启动子。早期研究表明，CMV立即早期增强子/启动子在大多数细胞类型中活性最强，被广泛用于DNA疫苗设计。此外，还有在正常细胞中无活性、仅在特定癌细胞中活化的癌症特异性启动子。其他优化还包括：使用视网膜特异性Kozak共识提高翻译率、添加Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件提高转录稳定性等。支架/基质附着区（S/MAR）也是一种被证明可增强转基因表达的元件，并已在mcDNA中用于改善表达谱。
图4.DNA序列优化
2.2
密码子优化
密码子优化通过改变密码子的使用来提升蛋白表达。由于宿主对基因序列表达具有偏好性，确定目标基因后进行序列优化，可增强蛋白表达及其免疫原性。64个核苷酸密码子中，61个参与20种氨基酸的编码，其余3个为翻译终止信号。遗传密码的简并性允许同一氨基酸由不同同义密码子编码——色氨酸和蛋氨酸由单密码子编码，其余18种氨基酸则由多个同义密码子编码。同义密码子并非随机或同频使用，这种使用不同频同义密码子的现象称为密码子使用偏差。影响CUB的因素还包括基因组背景核苷酸组成、剪接基序、保守的mRNA二级结构、氨基末端编码序列以及影响蛋白质折叠的约束等。
图5.DNA密码子优化
在密码子优化过程中，需重点考量：
1.密码子偏好；
2.mRNA二级结构——避免颈环发夹结构的形成，尤其是核糖体结合位点处的二级结构；
3.避免优化序列中的反式作用元件和一些限制性内切酶位点；
4.平衡GC含量至40%–60%；
5.综合考虑表达载体的结构特征。
目前多数公司使用智能算法优化相关序列，但需注意：密码子优化并不总是与DNA疫苗功效呈正相关；此外，同义密码子突变对蛋白质构象的潜在影响，在治疗性蛋白生产中也极具风险——可能导致药效降低和免疫原性并发症。
03
三、当新型DNA与优化策略走向产业化
本综述系统讨论了mcDNA、dbDNA、ceDNA等新型DNA的研究进展与优势，并从序列优化与密码子优化两个维度，剖析了DNA药物开发的思路与考量点，为DNA疗法的迭代升级提供了新方向。无论DNA形式如何演变，其底层需求始终一致：更高的表达效率、更低的免疫原性、更稳健的规模化生产工艺。
耀海生物深耕微生物表达体系CRDMO领域十余年，围绕质粒DNA构建了从质粒构建、菌种建库、工艺开发、GMP生产、制剂灌装、质量研究到注册申报的一站式服务闭环。对于mcDNA、dbDNA、ceDNA等新型DNA而言，无论上游的酶法合成或重组切除路线如何设计，最终载体的质量属性——超螺旋比例、内毒素水平、宿主残留、无菌保障——都需要在同一套工业化质量框架下被稳定实现和验证。
在工艺端，耀海生物的大肠杆菌高密度发酵平台将培养周期控制在30小时以内，质粒产量超过1 g/L，超螺旋比例稳定在95%以上，内毒素低于0.1 EU/mL，并采用无动物源、无抗生素工艺从源头降低安全风险。原液车间配备5条独立GMP生产线，发酵规模覆盖50L至2000L，总发酵能力达7500L，可实现从临床前到商业化的产能弹性匹配，避免阶段推进中更换CDMO伙伴带来的工艺转移风险。质量体系已通过欧盟QP审计，并于2024年通过国内首个重组质粒类药品的注册现场核查及GMP符合性检查。
在优化服务层面，耀海生物提供专业的密码子优化、重组质粒构建与高表达菌株筛选服务，与文章前述的序列优化和密码子优化策略直接衔接。对于正在评估mcDNA、dbDNA或ceDNA路线的团队而言，这意味着上游的载体设计理念可以与下游可放大的GMP生产在同一平台上完成对接，而不是在“创新结构”与“合规产能”之间反复割裂。
在实战验证上，国内首款获批上市的裸质粒基因治疗产品——诺思兰德的华索灵®，由耀海生物作为核心CDMO伙伴及唯一生产服务商全程陪跑至商业化。迄今，耀海生物已服务超过300家海内外客户，多个质粒项目覆盖IND至I、II、III期临床及商业化阶段。
新型DNA的价值在于让载体更“轻”、更“准”；序列与密码子优化让表达更“强”、更“稳”。而连接设计意图与临床可及性的，始终是一条经得起放大与核查的生产链路。在这条链路上，耀海生物裸质粒CDMO平台提供的，正是一个将新型DNA理念推向产业化的务实选项。
