在重组生物制药的生产版图中，大肠杆菌凭借数十年的技术积累、清晰的遗传背景和低成本的发酵体系，成为全球应用最广泛的重组蛋白表达宿主之一。据行业统计，目前超过25%的已上市重组生物药物都源自大肠杆菌表达系统，但该体系的固有短板也长期制约着生产效率：原核胞内缺乏真核蛋白正确折叠所需的分子伴侣、氧化还原环境等关键条件，高表达的重组蛋白往往会聚集形成无生物活性的不溶性颗粒——包涵体。
这类密度约1.3g/mL的蛋白聚集体，可通过高压匀浆结合差速离心实现初步富集纯化，大幅降低初始纯化的杂质负荷，但如何将错误折叠的变性蛋白聚集体，高效转化为具备完整空间构象与生物活性的可溶性蛋白，始终是下游生物工艺开发的核心瓶颈，而复性工艺的设计与优化，直接决定了整条包涵体生产路线的最终收率与商业化可行性。
01
一、蛋白复性的动力学底层逻辑
当前成核缩合模型已成为学界公认的蛋白质复性统一机制框架，该理论不仅适用于小分子蛋白的双稳态动力学折叠（折叠过程无中间体积累），也能适配多结构域复杂蛋白的复性过程——通过拆分每个独立结构域的折叠行为，完整描述多结构域蛋白的分步折叠路径。如果用折叠漏斗能量景观来可视化这一过程，整个复性体系呈现为多状态填充的能量分布：大量高能量的未折叠构象分布在漏斗边缘，而低能量的天然活性构象集中在漏斗底部，蛋白从异质性未折叠状态逐步向热力学稳定的天然态跃迁。
图1 折叠机制折叠漏斗能量形貌
在众多复性动力学模型中，Kiefhaber提出的竞争机制模型是工业工艺开发中应用最广泛的指导理论。该模型核心逻辑是：体外复性过程中，正确折叠与错误聚集是两条相互竞争的动力学路径，反应路径可简化为“未折叠态（U）→中间态（I）→天然活性态（N）”的递进过程。该理论明确指出，蛋白浓度的提升会对聚集体形成产生指数级放大效应，直接拉低复性最终收率；对于聚集速率远快于复性速率的难折叠蛋白，只有严格控制未折叠蛋白的局部浓度，才能获得具备经济可行性的复性产量，这一规律也成为后续所有工业复性策略设计的核心底层依据。
图2 Kiefhaber复性动力学模型的图示（A）；
复性产量与蛋白质浓度的相关性（B）
02
二、现代生物制药工业的复性工艺体系构建
完整的大肠杆菌重组蛋白生产全链条覆盖分子克隆构建、高密度发酵表达、包涵体分离纯化、蛋白复性、多步层析精制直至制剂灌装，而复性作为衔接上游包涵体粗品与下游高纯度活性蛋白的核心节点，是决定整条工艺经济性的关键步骤。
图3 在大肠杆菌中生产重组蛋白的工作流程示意图
2.1
包涵体处理的标准工业路径
包涵体的工业化处理已形成高度标准化的四步流程：
1.包涵体分离：工业生产中常将机械裂解（高压匀浆/超声）与酶法裂解（溶菌酶处理）结合使用，单一超声裂解会引入大量细胞碎片杂质，仅靠酶法裂解效率偏低，二者联用可获得高纯度的粗包涵体沉淀；
2.包涵体溶解：采用变性剂或去垢剂破坏蛋白内部疏水相互作用，常用试剂包括尿素、盐酸胍，以及十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠等强去垢剂，完全打开错误折叠的蛋白空间结构；
3.溶解蛋白复性：通过缓冲液环境调控，引导变性后的多肽链重新完成正确折叠，生成具备天然构象的活性蛋白；
4.复性后精制：组合多种液相层析技术，去除复性体系中的聚集体、错误折叠蛋白与残留杂质，获得高纯度的目标活性蛋白。
图4 从包涵体中分离生物活性蛋白的示意图
2.2
复性缓冲液的环境调控逻辑
不同目标蛋白（POI）的氨基酸序列、二硫键数量、空间结构差异极大，不存在通用的复性缓冲液配方，工业上通常需要通过系统性筛选确定最优条件，核心目标是构建一个既能加速天然态蛋白形成，又能最大程度抑制聚集与非天然构象稳定的化学微环境。
目前工业常用的复性添加剂可分为五大类，各自承担明确的功能角色：
・变性剂：以尿素、盐酸胍为代表，可完全破坏蛋白高级结构，实现包涵体的充分溶解；
・稳定剂：包括糖类与多元醇类物质，通过提升蛋白去折叠自由能、降低分子间缔合自由能，减少蛋白暴露在溶液中的疏水表面，通常与聚集抑制剂联用平衡效果；
・聚集抑制剂：典型代表为L-精氨酸，可通过部分结合蛋白表面疏水区域，同时发挥弱变性与促进溶剂化的双重作用，大幅抑制分子间聚集；
・pH调节剂：通过柠檬酸、磷酸盐、琥珀酸盐、甘氨酸等缓冲体系，将复性pH控制在远离蛋白等电点的区间，同时避免极端pH导致的蛋白永久变性，从基础层面降低聚集风险；
・氧化还原剂：针对含二硫键的蛋白，采用氧化型与还原型谷胱甘肽的组合体系，相比单纯空气氧化，可显著加速二硫键的正确配对，打破错配的非天然二硫键，大幅提升正确二硫键形成效率与复性速率。
在当前绿色生物制造的行业趋势下，工业复性试剂的筛选不再仅关注复性效果，还需同步评估试剂的毒性、采购成本与后续废液处理难度，兼顾生产过程的环境可持续性与整体经济性。
图5 蛋白质复性过程中使用的不同添加剂机制
2.3
工业级复性技术策略选型
复性技术策略的选择需要同时匹配目标蛋白的聚集倾向与生产规模，不同工艺路线各有适用场景：实验室阶段常用的稀释与透析法操作简便，但放大到工业规模后会产生大量复性缓冲液，大幅提升物料与储罐成本；错流超滤复性、层析柱上复性（包括尺寸排阻复性、吸附树脂结合复性）等技术，可在连续操作过程中逐步降低变性剂浓度，大幅减少缓冲液用量，更适配大规模工业化生产的成本控制需求。
03
三、工业级复性工艺的全流程开发路径
对于仅已知氨基酸序列的全新目标蛋白，复性工艺开发本质上是一个从“黑箱”状态逐步清晰化的过程，为了满足临床前样品快速交付、后续商业化生产稳健性的双重要求，现代生物制药行业已形成一套结合平台化流程、缩小模型与计算机建模的标准化开发体系，大幅压缩工艺开发周期。
图6 复性工艺开发路线图
3.1
高通量缓冲液条件筛选
传统单因素变量筛选模式耗时耗力，当前工业界普遍采用实验设计（DOE）结合自动化工作站的高通量筛选方案，先通过大范围初筛锁定复性缓冲液的核心参数区间，再针对关键影响因子开展精细化优化，微调复性微环境进一步提升最终复性收率。
3.2
集成化工艺流程设计
传统的串行工艺优化模式，仅将前一步的最优参数作为后一步的输入，完全忽略了上下游工艺步骤之间的耦合影响，容易导致整体工艺无法达到全局最优。目前行业开始引入集成过程模型与机器学习技术，打通各工艺步骤的参数关联，同时通过鱼骨图全面梳理机械参数、化学参数对复性过程的潜在影响，提前识别工艺风险点，构建稳健的全流程工艺。
图7 鱼骨图显示机械和化学过程参数对蛋白质复性过程的影响
3.3
工艺放大的科学落地
行业经验表明，80%以上的工艺设计改进空间都集中在早期小试开发阶段，此时实验成本低、调整灵活，可从根源上规避后续放大的潜在问题。在正式进入工业规模生产前，需先在具备代表性的中试规模开展工艺验证，结合计算流体动力学仿真模拟，提前预判大体积储罐、管道内的混合效果与反应分布，避免放大过程中出现局部蛋白浓度过高、混合不均导致的大量聚集问题。
Tips:
耀海生物的GMP-like级中试放大平台配备30L/69L规模的发酵体系与对应规格的层析系统，可完整覆盖工艺评估、工艺重现、参数优化与中试样品生产全流程，帮助客户快速完成重组蛋白原液工艺的放大、优化与转移，输出完整合规的中试放大报告，高效推进CDMO项目落地。
图8 新POI的流程开发生命周期
3.4
复性过程的数字化监测
复性过程长期以来依赖离线取样检测，数据滞后性容易引发批次间质量差异，近年来全球监管机构大力推动的过程分析技术（PAT）正在逐步解决这一痛点：一类是基于在线传感器的软测量方案，可实时监测体系的氧化还原电位、pH、温度的动态变化，及时识别工艺偏差；另一类是光谱类监测技术，可实时捕捉蛋白二级、三级结构的动态变化，结合差示扫描荧光法等辅助手段，快速区分未折叠态、错误折叠态与天然折叠态，实现复性过程的全流程闭环控制。
04
四、结语
尽管复性工艺开发仍存在诸多挑战，但包涵体表达路线本身具备的易分离、高稳定性、高表达量的核心优势，使其依然是重组生物制药极具性价比的生产路径。随着蛋白折叠机制研究的不断深入，叠加高通量筛选、机器学习建模、PAT在线监测等数字化技术的普及，未来包涵体复性工艺的开发周期将大幅压缩，工艺稳健性与生产收率也将提升到新的水平，进一步推动重组蛋白药物的低成本商业化落地。
