在生物制药领域，酵母菌是除大肠杆菌外另一种广泛使用的微生物表达系统，成熟的酵母表达宿主包括毕赤酵母、酿酒酵母和汉逊酵母。凭借遗传背景清晰、操作成熟、基因整合稳定等优势，酵母表达体系已成功支撑多种预防或治疗类商业产品的生产——如病毒样颗粒（VLP）疫苗、重组GLP-1类似物、重组胰岛素及胰岛素类似物、干扰素、尿酸酶、纤溶酶片段等。

图1 基于酵母菌表达的重组生物制品类型

其中不乏多款重磅产品：默沙东的九价HPV疫苗、诺和诺德的司美格鲁肽以及多款胰岛素类似物（门冬胰岛素、德谷胰岛素及超长效的Insulin icodec等）均基于酵母表达平台生产。

此外，多款基于酵母表达的重组多肽/激素、细胞因子、生长因子、治疗用酶、纳米抗体及融合蛋白正处于开发阶段，应用版图仍在持续扩张。

一、为什么菌种建库是酵母表达的“生命线”？

与其他微生物或真核细胞表达宿主一致，开发毕赤酵母、酿酒酵母和汉逊酵母等表达系统的最终目标，是实现生物药活性成分的可及性与产业化。而在多批次、连续化生产需求的驱动下，生产用菌种的质量合格性与均一性对产品质量有着至关重要的影响。

实施菌种库系统是保证生产用菌种质量可控、降低潜在风险的有效措施。 ICH为此制定了Q5D《用于生物技术产品及生物制品生产的细胞基质的来源和鉴定》，各国药典也针对菌种建库制定了相应规范，为生物制品菌种库的制备和检定提供指导意见。

对于重组生物制品，三级菌种库是行业通行的菌种管理体系：

・原始菌种库（PCB）：筛选获得的优势菌克隆培养形成传代稳定的均一菌液；

・主菌种库（MCB）：由PCB传代、扩增、保存制备而来；

・工作菌种库（WCB）：由MCB传代、扩增、分装制备而成。

三级库的职责划分清晰：MCB用于制备WCB，WCB直接用于重组生物制品的生产。这一层层递进的架构，确保了每一批次生产所用菌种的可追溯性与质量一致性。耀海生物遵循ICH指导原则与药典，结合丰富项目经验，形成成熟的酵母菌种建库服务流程。

图2: 酵母菌菌种建库的流程

二、酵母菌种建库全流程解析

2.1

优势菌筛选与PCB建立：

高拷贝筛选是重中之重

酵母表达系统区别于大肠杆菌的一大特征在于：外源基因并非以游离质粒形式存在，而是整合在基因组中。这一特性带来一个关键挑战——在电转过程中，可能产生不同拷贝数的工程化酵母，导致不同菌株间的外源基因拷贝数和蛋白表达量存在大幅差异。

因此，对酵母表达系统而言，高拷贝、高表达量菌种的筛选至关重要。行业领先的耀海生物已建立高通量的优势菌筛选平台——仅通过这一筛选策略，即可实现重组蛋白表达量提高至3倍以上，从源头压缩了后续工艺优化的难度与成本。

获得优势菌后，我们将其克隆培养形成传代稳定的均一菌液，即为PCB。检定合格的PCB用于制备MCB。需要强调的是，经验丰富的服务商会合理评估PCB的制备数量，以同时满足菌种质量放行、菌种稳定性检测和后续规模化生产等多重需求——既不浪费资源，也避免因库量不足导致的重复建库。

2.2

GMP二级库建立（MCB与WCB）：

环境合规是底线

一瓶或几瓶成分均一的PCB经传代、扩增、分装，制备得到一定数量的MCB；MCB再经传代、扩增和分装，制备得到WCB。

与PCB数量的评估逻辑相同，委托方和服务商应依据检测需求和产品的潜在市场，评估MCB与WCB的制备数量——既要覆盖全生命周期的检定与生产需求，也要为未来商业化放大预留充足余量。

二级库建立的核心要素在于：车间环境必须符合GMP规范。

有效的预防措施是确保菌种库不被污染的最为可靠的方法。

为此，领先的耀海生物建立了独立的GMP级MCB与WCB建库车间，由专业人员在C级洁净区背景下的A级洁净区内完成建库操作，从环境层面杜绝二级菌种库的污染风险——这是菌种库质量合规的硬件保障。

2.3

优势菌筛选与PCB建立：

高拷贝筛选是重中之重

菌种库的检定是生物制品质量控制（QC）的重要环节，其核心目的在于保证生产用菌种的特性稳定。

酵母菌菌种库的检定项目涵盖：

・菌种鉴别试验：确认菌种身份；

・目的产物鉴别试验：验证外源基因的表达产物正确性；

・纯度检测：排除杂菌污染；

・稳定性研究：评估传代与储存过程中的遗传与表达稳定性。

不同用途的菌种库对应的具体检测项目存在差异，需依据ICH指导原则与各国药典要求，结合产品注册策略进行针对性设计。

2.4

菌种库的合理储存：

双重保障降低风险

菌种是生产活动的起始原料，是一种重要的资源。菌种库需选择合适的保藏方法并置于合适的环境，以维持菌种的特性稳定。

主流的保藏方案包括：

・甘油管保藏：置于超低温冰箱（-80℃）或液氮环境中，适用于中期与长期储存；

・冻干保藏：适用于超长期保存，进一步提升菌种稳定性。

此外，行业先进的耀海生物还可提供菌种库的异地储存服务——通过在不同地理位置建立备份，将单点灾害（火灾、设备故障等）导致的菌种库损失风险降至最低，为持续多年的产品生命周期提供双重保险。

三、结语

从高拷贝优势菌的高通量筛选，到GMP环境下的三级库建立，再到系统的检定放行与多重储存保障——酵母菌种建库是一项贯穿法规合规、工艺技术、质量管理的系统工程。一个高质量的菌种库，不仅是重组生物制品顺利进入IND申报与临床生产的通行证，更是产品全生命周期质量稳定性的基石。

对于正布局酵母表达管线的企业而言，选择具备独立GMP建库车间、成熟高通量筛选平台与丰富项目经验的CDMO伙伴，能够有效规避建库过程中的技术陷阱与合规风险，让菌种建库从“拦路虎”变为“加速器”。