近年来，重组蛋白在工业、农业及生物医药领域的应用日益广泛。凭借其表达量高、培养周期短及生产成本低等显著优势，大肠杆菌始终是工业生产中最核心的细菌宿主之一。
然而，在利用大肠杆菌表达重组蛋白时，研究人员常常面临一个棘手的技术瓶颈：重组蛋白极易以不可溶且无生物活性的“包涵体”形式存在。这一问题给在实验室或工业规模上提取具有正确折叠和生物学活性的可溶性蛋白带来了巨大挑战。为此，学术界与工业界通过对包涵体形成机制、影响因素及独特性质的深入剖析，开发出了一系列旨在减少大肠杆菌中包涵体形成的有效策略。
一、包涵体：定义与特征
1.1/什么是包涵体
包涵体（Inclusion Bodies, IBs）是细胞内部形成的大分子聚集体，主要成分为蛋白质，可分布于细胞核、细胞质或周质空间。它的出现通常源于蛋白质折叠、组装与降解之间的失衡——可能是外源基因过表达、突变蛋白积累，或环境压力导致折叠系统超负荷所致。形态上，IBs多为高密度、不溶性的蛋白质颗粒，呈现无定形结构，有的被膜包裹，有的则裸露存在。
图1 大肠杆菌细胞中的蛋白质稳态网络图
1.2/为何会形成包涵体
在大肠杆菌中，包涵体的形成是一个由多种因素共同作用的复杂过程：
・蛋白自身特性：高表达率、高分子量、疏水残基较多且结构无序的蛋白质更易形成包涵体。
・表达速率失衡：在高强度表达条件下，蛋白质的合成速率远超其正确折叠所需时间，导致错误折叠概率激增；同时，能量需求增加引发细胞应激与代谢负担，进一步加剧错误折叠风险。
・翻译后修饰能力不足：作为原核生物，大肠杆菌缺乏支持糖基化等复杂翻译后修饰的亚细胞结构。特别是对于含有二硫键的蛋白，由于大肠杆菌胞内形成二硫键的能力有限，该步骤常成为正确折叠的限速环节，极易导致蛋白错误折叠与聚集。
・环境因素：培养温度、pH值等环境条件的波动也会显著影响包涵体的形成。
1.3/包涵体的若干独特性质
1.结构特性：通常为缺乏适当结构和功能的无定形聚集物。但在某些研究中（如β-半乳糖苷酶和天冬酰胺酶），也观察到了类似有序的淀粉样结构，并表现出一定的功能性。
2.高纯度共聚：大肠杆菌包涵体主要由高度同质的蛋白质自身共聚而成，实际上是高纯度重组蛋白的一种存在形式，具备进一步开发利用的价值。
3.极点分布：在细胞内，包涵体特异性地分布在极点或分隔位点，这种非对称分布导致分裂后的两个子细胞中仅有一个继承包涵体。
4.光散射现象：包涵体形成释放后，大肠杆菌裂解液常呈现类似“牛奶样浓汤”的浑浊状态。
二、减少包涵体形成的五大策略
2.1/优化细菌培养条件
调控培养条件是操作最简便、见效较快的策略之一。关键参数包括温度、诱导剂浓度、添加剂及pH值。
・低温诱导：采用两阶段培养——先在37°C下快速积累生物量，再降温至15–20°C诱导表达，可显著改善Tri101乙酰基转移酶、DepA/DepB等多种蛋白的可溶性[3-5]。短时热激（47°C，30 min）预处理也是一种可行手段。
・诱导剂精准调控：IPTG是乳糖操纵子的经典诱导剂。通过降低IPTG浓度或在培养基中添加葡萄糖，可下调目标基因转录速率，减轻代谢负担，为正确折叠争取时间。
2.2/宿主菌株工程改造
从宿主层面着手，构建更"友好"的胞内环境，是减少IBs形成的根本途径之一。
・促进二硫键形成：使用Origami、SHuffle等工程菌株，其胞质具有氧化特性，可支持二硫键的正确配对[6,7]；CyDisCo系统则通过调控氧化还原平衡，同样有效提升含二硫键蛋白的可溶性表达。
・强化N-糖基化能力：错误糖基化易诱发蛋白聚集。通过引入关键酶（如PglB）重建N-糖基化途径，或利用lpp基因突变株改善外膜通透性，有助于糖蛋白（包括抗体片段）的正确折叠与分泌。
・引入辅助折叠因子：共表达折叠酶（如PDI、PPI）或分子伴侣，可稳定未折叠中间体，引导其走向正确折叠路径，减少聚集。
・适配毒性蛋白表达：对于膜蛋白等毒性较强的目标蛋白，可采用C41(DE3)、C43(DE3)或BL21(DE3)pLysS等突变菌株，通过降低T7RNA聚合酶活性来减弱转录强度，缓解宿主毒性[8]。BL21(DE3):TN7菌株则借助T7噬菌体RNA聚合酶抑制剂Gp2，实现表达与生长的解耦，同样降低了IBs比例[9]。
・优化金属辅因子供应：对金属酶而言，辅因子的充足供给是正确折叠的前提。过表达特定金属离子摄取相关操纵子，可改善金属辅因子的胞内可用性，从而减少因辅因子缺失导致的聚集。
图2 大肠杆菌菌株工程领域在应对重组蛋白表达中
IBs形成问题方面的新进展
2.3/新型表达载体的合理设计
载体设计直接决定转录强度与翻译速率，是调控IBs形成的关键环节。
・融合标签策略：将目标蛋白与高可溶性标签（如MBP、GST）、分子伴侣或特定折叠辅助肽融合，可提高其溶解性并引导正确折叠（见图3）。
・弱启动子与低拷贝质粒：使用较弱启动子或低拷贝数载体，可降低合成速率，使折叠系统能够"从容"处理新生肽链。双载体共表达系统（高拷贝+低拷贝组合）在实现多亚基蛋白复合物的可溶性表达方面展现出良好潜力。
图3 融合表达载体的设计
2.4/目标蛋白本身的工程化改造
蛋白自身的氨基酸序列决定了其折叠行为，因此对其"先天属性"进行优化可从根源上降低聚集风险。
・生物信息学预测与突变：借助Protein-Sol、SoDoPE等工具，识别蛋白序列中的聚集"热点"区域，通过定点突变移除这些不利特征，提高可溶性。
・亚细胞定位改变：将目标蛋白通过信号肽（如OmpA、PhoA）引导至周质空间表达，利用该区室的氧化环境和丰富的折叠酶体系，可有效促进二硫键形成，获得具有生物活性的可溶蛋白。
三、包涵体并非"一无是处"——工业应用中的独特价值
尽管IBs中的蛋白通常丧失天然构象与活性，需经变性-复性处理才能恢复功能，但其独特物理特性在某些工业场景中反而成为优势：
・机械与化学稳定性优异：IBs在极端pH、温度及蛋白酶环境中仍能保持结构完整，适合作为药物递送载体、蛋白质封装材料等生物医学应用的基础构件。
・易于分离纯化：IBs密度大、溶解度低，通过简单离心即可与大量可溶性杂蛋白分离，大幅简化下游纯化流程，特别适合大规模生产。
・功能化利用潜力：IBs不仅可作为重组蛋白的储存形式，还可作为重要药物前体或抗菌肽的表达纯化平台。
・实际生产案例：在1-丁醇等大宗化学品的生物合成中，利用IBs作为固定化酶载体已实现比传统路线更高的产率，展现出在化妆品、食品等领域的应用前景。
四、结语与展望
减少大肠杆菌中包涵体的形成，是一项涉及多层面的系统工程。当前策略已覆盖培养条件调控、宿主菌株工程、表达载体优化、蛋白序列改造等维度，并取得显著成效。未来，随着对IBs成核机制、折叠调控网络及复性技术的深入理解，有望开发出更智能、更高效的生产平台。跨学科融合——将合成生物学、结构生物学与过程工程相结合——将进一步拓展IBs的应用边界，推动重组蛋白生产向更高效率、更广领域迈进。
