【干货】mRNA疫苗序列设计：多表位抗原如何串联？

肿瘤通常具有高度的异质性，单一抗原设计肿瘤疫苗往往不足以诱导全面免疫，多表位（multi-epitope）抗原串联设计成为主流策略。

本文参考BioNTech、Moderna发表的文献、专利，整理了多表位mRNA疫苗序列设计的实用建议，重点在于CDS区域的设计，如何科学串联多个抗原表位，使其同时兼顾表达、加工和免疫原性。

内容详解

1.1为什么需要多表位串联设计？

传统全长抗原疫苗可能存在以下问题：

・中枢免疫耐受： 免疫系统通常对广泛表达的自身蛋白质（全长抗原的大大部分）具有耐受性。研究观察到，针对新抗原（仅包含突变位点的小段序列）的T细胞反应通常比针对全长共享肿瘤相关抗原（TAA）的反应更强。

・自发识别效率低：肿瘤中仅有极小比例的突变能诱发自发的免疫应答，使用全长抗原会使免疫系统分散精力去处理那些不具免疫原性的部分。

・缺乏精确性： 在全长序列中，关键的突变位点可能不一定被高效剪切并呈递在 HLA 分子上。

多表位疫苗通过筛选保守、高免疫原性的B细胞表位（LBL）、细胞毒性T细胞表位（CTL）和辅助T细胞表位（HTL），实现“精准打击”。

多个表位串联后，可同时激活体液免疫和细胞免疫，提高广谱性和记忆响应。这种设计能够避开免疫耐受、防止肿瘤逃逸以及优化呈递效率，克服了传统全长抗原疫苗在抗肿瘤疗效上的局限性。

mRNA平台特别适合这一策略：只需将串联的氨基酸序列反向转录成密码子优化核酸序列，即可快速构建编码区。

1.2多表位串联设计的核心原则

1、CDS组成

・N端：信号肽（如tPA），促进抗原分泌。

・中间：多表位抗原区域。表位设计中将体细胞突变（SNV）置于该肽段的中间位置，目的是为细胞内加工预留足够的侧翼序列，确保在任何排列顺序下都能产生多种 HLA结合表位。

・C端：MITD（MHC I类运输域）等序列，帮助抗原加工呈递。

2、多表位排列顺序

表位选择：通过免疫信息学工具（如NetMHC、IEDB）预测高亲和力、保守、非毒性、非过敏表位。

BioNTech公司的Sahin 等人在 2017 年发表的研究中明确指出，免疫原性突变在五表位mRNA的五个位置上分布非常均匀。这意味着无论新抗原处于序列的第一个位置还是最后一个位置，其诱导免疫反应的能力没有显著差异。

而Moderna在专利中建议，多表位排列应遵循最小化“假表位”（Pseudo-epitopes）的原则。具体操作方法是：通过改变串联体中各个肽段的排列先后顺序，利用算法对串联体中所有肽段接头处的序列进行扫描，控制接头片段与HLA分子的结合亲和力（例如：IC50＞50 nM, ＞150 nM, ＞300 nM），实现消除或减少形成高风险假表位。

3、连接子（Linker）

BioNTech在Nature 2017文献中，明确公开了3种不同位置的Linker序列：

・起始端（Position 1 之前）： 建议使用LQ或GGSGGGGSGG连接信号肽与第一个抗原。

・中间连接（Position 1-5 之间）： 统一采用非免疫原性的甘氨酸/丝氨酸GGSGGGGSGG接头来串联5个抗原单元。

・末端（Position 5 之后）： 建议使用GGSLGGGGSG连接最后一个抗原与运输域（MITD）。

Moderna在专利中列举了三类连接方法：无Linker、G Linker、短肽Linker或者裂解敏感位点。但无论是否使用Linker，核心要求是确保肽段连接处形成的序列与HLA分子的结合亲和力（IC50）大于50 nM（越高越安全），以保证连接处不具备免疫原性。

整体来看，直接串联存在产生“连接处新表位”（junctional epitopes）的风险，如控制mRNA长度，通过生信预测接头片段无高结合活性的情况下可以不添加linker；如果预测存在风险，可添加甘氨酸或者GS肽段作为linker。

02、mRNA个性化疫苗实验流程示例

1.表位预测与筛选（多工具共识）

2.设计氨基酸串联序列（信号肽-Linker-表位串联-Linker-MITD）

3.密码子优化得到核酸序列

4.添加mRNA非编码元件（UTR、polyA），合成或克隆得到质粒DNA模板