体外转录（IVT）过程中不可避免产生的副产物——双链RNA（dsRNA），始终是制约mRNA药物安全性和有效性的关键瓶颈。这种具有高度免疫原性的杂质会强烈激活细胞内的先天免疫信号，诱导促炎细胞因子的释放，进而显著抑制mRNA的翻译效率。尽管现有的离子对反相色谱（IP-RPC）或纤维素色谱在去除dsRNA方面取得了一定进展，但前者依赖有机溶剂且放大成本高，后者则面临回收率不稳定及线性放大难等困境。
在这一背景下，Jasmina Puc等人的研究提出了一种基于pH变性的全新纯化策略，通过靶向氢键稳定性来实现dsRNA的高效去除，结合oligo dT层析工艺，为高质量mRNA药物的大规模生产开辟了新方法。
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研究内容详解
研究首先探讨了通过调节pH破坏碱基配对的理论可行性。dsRNA结构的稳定性本质上依赖于胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）、腺嘌呤（A）与尿嘧啶（U）之间的氢键相互作用。胞嘧啶N3位的pKa约为4.2，腺嘌呤N1位的pKa约为3.5。这意味着当环境pH降低至3.5以下时，这些位点会发生质子化，从而精准阻断氢键的形成，导致dsRNA发生链分离。
实验数据有力地支持了这一理论假说。在针对eGFP、FLuc、Cas9及mCHIK saRNA等多种长度（1 kb至10 kb）的构件测试中，J2免疫印迹结果显示，随着pH从6.0逐渐降至3.0，dsRNA的特征信号迅速减弱，并在pH ≤ 3.5时完全消失。令人欣喜的是，这种质子化驱动的变性过程极其迅速，在5秒内即可完成，且不会对mRNA主链的完整性造成破坏。
尽管酸性条件能使dsRNA分离，但研究揭示了一个关键的技术挑战：变性过程在特定条件下具有可逆性。当pH回调至中性或加入高浓度盐离子（如Oligo dT结合所需的0.5 M NaCl）时，样本中残留的互补RNA链会重新退火形成dsRNA结构。通过IP-RPC纯化样本的对比实验证实，这种J2信号的重现并非检测干扰，而是由于杂质链的重新杂化所致。
研究团队开发了一种创新的在线酸化（In-line acidification）结合Oligo dT亲和色谱的工艺。通过精密控制三台泵的流速，使mRNA在进入色谱柱前与pH 3.0的甘氨酸缓冲液在线混合30秒完成变性，随后立即与结合缓冲液混合并载入柱内。
在这种模式下，mRNA的聚腺苷酸（poly(A)）尾部优先与磁珠上的Oligo dT配体结合，而解离下来的dsRNA杂质链及短片段RNA则留在穿透流（FT）中被洗脱移除。实验结果显示，该方法成功将多种mRNA的dsRNA含量从0.14%–0.77%显著降低至0.02%–0.09%，且mRNA回收率保持在90%以上。
据耀海生物内部数据，经oligo dT亲和层析和离子交换层析等纯化步骤，dsRNA含量可降至0.08%以下，其纯化效果同样不逊于同类主流方法。
通过对纯化过程中的FT馏分进行分析，研究者发现被移除的不仅包括200–500 nt的短RNA片段，还包括2000–4000 nt的长链RNA。这些长链杂质在J2印迹中表现出强信号，推测为由于顺式杂化而无法结合Oligo dT的3'端延伸转录本。
最终的细胞实验提供了最核心的价值证明。在对干扰素不敏感的BHK-21细胞中，经不同方法纯化的mRNA表达水平相当，证明pH 3处理未损伤RNA功能。但在免疫响应活跃的A549细胞中，经pH 3-Oligo dT纯化的mRNA其转基因表达量较常规纯化提升了约5倍，saRNA的表达提升约6倍，并几乎完全消除了IFNβ的早期分泌，极大地降低了潜在的免疫副作用。
02
创新与局限
创新性： 该工作首次证明了利用质子化驱动的氢键断裂可以作为mRNA精制的一种通用且高效的手段。其核心优势在于脱离了对昂贵或有害化学试剂（如乙腈）的依赖，转而使用廉价、安全的酸性缓冲体系，且与目前临床验证的Oligo dT捕获技术完美兼容。研究不仅在小量级进行了机理探索，更通过在线混合技术解决了mRNA在酸性环境下的稳定性与纯化效率之间的平衡难题，实现了从1 kb到10 kb saRNA的广谱适用性。
局限性： 尽管该方法效果显著，但论文原文也指出了特定的局限性。首先，IVT反应混合物中的某些成分（如精胺和氯化镁）会干扰酸性条件下的dsRNA变性，因此该方法无法直接应用于粗样品的首步纯化，必须先进行缓冲液置换或初步捕获（如预纯化的Oligo dT步骤）。其次，对于残留DNA的去除虽然有所提升，但并非彻底清除，特别是编码聚腺苷酸序列的单链DNA仍可能结合在色谱柱上，这意味着该工艺目前仍需与正交的除DNA手段（如酶解）联用。
结语
Jasmina Puc等人的研究挑战了dsRNA去除必须依赖复杂色谱技术或昂贵酶处理的传统认知。通过深入挖掘核苷酸在亚稳态pH下的物理化学响应，他们成功构建了一个“变性-捕获”协同系统，将杂质去除率提升到了此前仅IP-RPC能达到的水平，同时规避了有机溶剂的风险。
这一发现的影响力不仅限于提高实验室产量，更在于其为mRNA药物的大规模产业化提供了极具成本效益的方案。在线酸化的设计思想极易整合进现有的自动化液相色谱平台，符合工业4.0背景下的连续化生产趋势。随着这一技术向多克量级及临床应用阶段的迈进，pH变性纯化范式有望成为未来mRNA疫苗生产的标准配置，助力更多基于RNA的疗法从实验室走向临床。
