在mRNA药物的整体生产流程中，主要包含三个工艺环节，即质粒DNA的制备、mRNA原液的制备以及LNP-mRNA成品的制备。其中，质粒DNA的制备作为mRNA药品生产的第一个工艺步骤，具体又涵盖了序列设计、重组质粒构建，以及后续的质粒发酵、粗纯和精纯等多个操作阶段。
进一步来看，质粒构建属于质粒模板制备过程中的上游工艺，其核心任务是获得含有目的基因的重组载体，从而便于后续对目的基因进行扩增、鉴定以及线性化等操作。需要指出的是，由于mRNA生产对序列设计有着特殊要求，例如需要进行密码子优化、添加非翻译区（UTR）和polyA尾等，传统的质粒构建操作常常被基因合成技术所取代。不过，对于序列长度较长、或者保密要求较高（例如含有特定突变体）的基因序列，研发人员仍然会采用序列拼接的方法来完成质粒构建工作。
在本文中，将以双酶切法和一步克隆法为例，详细展示重组质粒的具体构建流程。
01
一、空质粒与目的基因的扩增备料
在重组质粒构建的初始阶段，首先需要完成对空质粒和目的基因的扩增，其目的在于获得足量的空质粒载体及目的基因片段，以用于后续的酶切连接反应。
1、空质粒扩增（大肠杆菌法）
・操作：将含空质粒的大肠杆菌接种于LB液体培养基（需添加质粒对应抗生素）中。
・培养：过夜震荡培养，待菌体增殖充分后，通过离心收集菌体沉淀。
・提取：按照商业试剂盒说明（如生工柱式质粒DNA小量抽提试剂盒）完成质粒抽提与纯化，从而获得高拷贝的空质粒DNA。
2、目的基因扩增（PCR法）
・体系配置：模板DNA、两端引物、dNTPs（dATP/dGTP/dCTP/dTTP）、含Mg²⁺缓冲液、耐热DNA聚合酶（Taq或Pfu）。
・程序设定：预变性 →（变性-退火-延伸）×30~35个循环 → 终延伸。
・纯化回收：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，切胶回收目的片段。
在具体质粒构建方法的选择上，需要注意以下两点：
・若采用双酶切法构建重组质粒，则应根据所选用质粒载体上的多克隆位点图谱，合理选择限制性内切酶的酶切位点，同时务必确保所选位点不会切割目的基因内部序列。
・若采用一步克隆法（又称同源重组法）构建重组质粒，则需通过引物设计和PCR扩增，使目的基因片段两端分别引入与线性化载体末端互补的同源序列，同源序列长度通常为16～20 bp。
图1: PCR扩增原理
02
二、目的基因与载体的连接
在重组质粒构建过程中，获得足量的空质粒和目的基因片段之后，需要将二者有效地连接起来。目前常用的连接方法主要包括双酶切-连接法和一步克隆法（即同源重组法）。以下分别对这两种方法进行详细阐述。
2.1
双酶切-连接法
该方法的原理是：利用限制性内切酶对空质粒和目的基因分别进行切割，使二者产生相同的黏性末端或酶切缺口，从而便于后续通过DNA连接酶实现共价连接。
限制性内切酶的双酶切处理
限制性核酸内切酶是一类能够识别并切割特定双链DNA序列的酶。在DNA重组实验中，II类限制性核酸内切酶由于具有识别序列与切割位点的双重特异性，因而被广泛应用。通常情况下，II类限制性核酸内切酶识别的碱基序列长度为6～8 bp，并且这些识别序列大多呈现180°旋转对称的回文结构。例如，EcoRI的识别序列为5’-GAATTC-3’，其互补链为3’-CTTAAG-5’，二者形成典型的回文结构。在常规实验中，常用的限制性内切酶还包括BamHI、HindIII等。
为了避免空质粒在连接过程中发生自身环化（即自连接），实际操作中通常选择两种不同的限制性内切酶对质粒进行双酶切，从而产生两个不相容的黏性末端。这样一来，质粒的两端无法直接相互连接，从而有效降低非重组背景。与此同时，目的基因片段也需要使用相同的两种限制性内切酶进行切割，使其两端带上与质粒互补的缺口。酶切反应结束后，产物需要通过柱纯化或琼脂糖凝胶电泳回收的方式加以纯化，以去除酶切产生的短片段、残留酶以及缓冲液中的杂质，从而为后续的连接反应提供高质量的DNA底物。
T4 DNA连接酶介导的连接反应
T4 DNA连接酶是连接反应的核心工具，可催化DNA双链上相邻的3’-羟基与5’-磷酸基团形成3’-5’磷酸二酯键，将具有相同末端的DNA片段连接。将酶切纯化的质粒与目的基因按一定摩尔比混合，加入T4连接酶进行反应，即可获得质粒-目的基因的重组连接液。
图2 双酶切-连接法构建重组质粒的流程示意图
2.2
一步克隆法（同源重组连接法）
由于双酶切-连接法的操作步骤较为繁琐，并且目的基因序列内部可能恰好包含所选择的限制性酶切位点，导致双酶切策略难以适用，因此，基于同源重组的连接方法（即一步克隆法）在当前的分子克隆实验中得到越来越广泛的应用。
一步克隆法的核心在于使用Gibson组装缓冲液，该缓冲液体系中包含三种关键的酶类成分：第一种是5’→3’核酸外切酶，其作用是从DNA片段的5’端逐步切除核苷酸，从而暴露出3’端的同源序列，便于不同片段之间通过同源区发生退火配对；第二种是DNA聚合酶，它能够在同源序列正确配对后，对存在的缺口进行填补和延伸，确保序列的准确匹配；第三种是DNA连接酶，其功能是将经过配对和填补后仍然存在的切口共价连接起来，最终形成完整的环状重组质粒。
通过上述三种酶的协同作用，可以将带有互补同源末端的线性化载体和目的基因片段在一管反应中高效地组装成闭合环状的质粒-目的基因重组产物。
图3: 同源重组法构建重组质粒
03
三、转化与鉴定
在完成重组质粒的体外连接之后，需要将连接产物导入到合适的受体细胞中，这一过程被称为转化。为了验证重组质粒的构建是否正确，通常选用大肠杆菌作为受体细胞，并采用热激转化法进行操作。
3.1
连接液转化（热激法）
将构建好的重组质粒导入受体细胞的过程称为转化。常规鉴定常以大肠杆菌为受体，操作步骤如下：
・混合：将连接液与大肠杆菌感受态细胞（如E.coli DH5α）混合。
・冰浴：冰上放置30 min。
・热激：42℃水浴处理90 s。
・复冰：迅速转移至冰浴中1-2 min。
・复苏：加入1 mL新鲜培养基，37℃培养1小时。
・筛选：涂布至含对应抗性标记的固体培养基上，长出的菌落即为转化子。
3.2
重组质粒验证（双酶切+测序）
需要注意的是，在体外连接反应中，连接效率和转化效率很难达到100%。因此，实际获得的转化子中通常包含两类：一类是期望的重组子，即成功插入了目的基因的重组质粒；另一类是非期望的重组子，例如空质粒自连接形成的转化子，或者插入非目标片段的质粒。为了从众多转化子中筛选出正确的重组质粒，需要通过双酶切鉴定和测序验证两个步骤进行确认。以下简要介绍鉴定方法：
・扩培提质粒：挑取平板转化子转接扩培，提取质粒。
・双酶切电泳：使用两种限制性内切酶切割质粒并进行电泳。若观察到两条带，且分别与载体长度、目的基因长度一致，即为初筛阳性。
・测序验证：将初筛阳性的质粒送测，序列正确则标志重组质粒构建成功。
图4: 连接液的转化与鉴定
