实体瘤因其复杂的微环境、致密的间质屏障和强烈的免疫抑制特性，长期被视为抗体药物的“难治堡垒”。传统单克隆抗体（mAb）虽在肿瘤治疗中取得里程碑式进展，但其大分子量（约150 kDa）限制了组织渗透深度，且Fc段介导的非特异性效应常带来脱靶毒性。在此背景下，源自骆驼科动物或鲨鱼的单域抗体（sdAbs）——即纳米抗体（Nanobodies, Nbs），凭借其分子量仅为传统抗体的十分之一（约12~15 kDa）、高亲和力、极端稳定性和易于工程化改造等优势，正迅速成为实体瘤精准治疗的新锐力量。
本文系统梳理了Nbs临床转化的关键瓶颈——免疫原性问题的解决策略，并围绕其四种主要治疗形式，综述其在实体瘤治疗中的前沿进展。
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一、破局动物源性限制：纳米抗体的人源化策略
纳米抗体的动物源性特征可能导致人体免疫系统将其识别为“异己”成分，尤其是在与化学毒素或多肽分子偶联形成复合物时，免疫原性风险显著加剧，可能成为阻碍长期临床应用的关键瓶颈。借鉴鼠源抗体人源化的成熟经验，当前Nbs的人源化主要依托两大核心策略：
CDR移植技术：即将异种纳米抗体中决定抗原特异性的互补决定区（CDR），精准“剪接”并移植至人源抗体的框架区（FR）中。例如，Vaneycken团队将靶向癌胚抗原（CEA）的NbCEA5成功移植至通用人源支架。尽管表面等离子体共振检测显示其亲和力较野生型下降了约30倍，但竞争结合实验证实其抗原表位高度一致，后续可通过亲和力成熟技术进一步优化。
表面重塑技术：通过同源建模与序列比对，将非人源FR区中暴露在表面的关键残基，替换为人类抗体FR区对应位点的氨基酸。由于表面残基是免疫系统识别的主要靶点，此法能高效“伪装”异源蛋白。Kazemi-Lomedasht团队利用计算机辅助预测，对抗VEGF纳米抗体的FR区9个关键位点进行定点突变，获得的人源化Nb43在ELISA亲和力未发生显著改变的前提下，依然保持了强效抑制血管内皮细胞增殖的生物学功能。
图1 抗体人源化示意图
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二、迈向零免疫原性：全人源纳米抗体开发
全人源抗体因其序列完全源自人类自身免疫球蛋白库，不含任何异源成分，被视为最安全的长期治疗载体。由于人类天然免疫系统中缺乏重链抗体的同源结构，全人源Nbs的开发高度依赖四大前沿技术路径的协同：
1.噬菌体展示技术：作为目前最成熟的主流方法，已成功孵化出阿达木单抗等重磅药物，通过构建大容量天然全人源纳米抗体文库，实现高亲和力克隆的快速淘选。
2.转基因小鼠模型：通过基因敲除与敲入技术，将小鼠自身的免疫球蛋白基因替换为人类基因，使小鼠在抗原刺激下直接产生全人源抗体。
3.单B细胞高通量筛选：结合微流控分选、细胞微阵列芯片等前沿平台，从康复患者或免疫动物的单个B细胞中快速鉴定抗原特异性克隆。
4.AI与计算设计：近年来，基于同源建模或深度学习（如AlphaFold等）的计算设计方法正在重塑抗体工程，推动全人源Nbs开发进入智能化新阶段。
针对人源结构域天然存在的稳定性与溶解度缺陷，研究者常引入额外二硫键增强构象刚性，或在极端苛刻条件下（如高温、强变性剂）淘选噬菌体展示文库，亦或将高亲和力供体CDR移植至超高稳定性的天然支架上，以兼顾疗效与药代动力学属性。
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三、实体瘤治疗中的多维纳米抗体技术
实体瘤的发生伴随着基因异常驱动的信号通路失调与免疫微环境重塑。逆转这种高度复杂的免疫抑制网络需要多重机制协同干预。基于功能修饰与组装策略，抗肿瘤纳米抗体主要演进为四大形态：
3.1/靶向精准打击：偶联纳米抗体
传统抗体偶联药物（ADC）受限于大分子量，难以穿透实体瘤致密基质。纳米抗体药物偶联物由此应运而生。通过智能连接子将细胞毒性载荷（化疗药、毒素、光敏剂或放射性核素）与高亲和力Nbs偶联，能够识别肿瘤隐蔽表位并大幅降低脱靶毒性。
・化疗与免疫毒素：铂类与阿霉素是最常用载荷，如抗EGFR纳米抗体偶联铂类药物可选择性诱导癌细胞凋亡；免疫毒素则通过靶向结构域与毒蛋白融合实现高效杀伤。
・光动力疗法（PDT）：Nbs偶联光敏剂（如IRDye700DX），在特定波长光照下产生活性氧（ROS）定点清除高表达EGFR/HER2的肿瘤细胞，甚至能克服曲妥珠单抗耐药。
・靶向放射性核素治疗（TRT）：使用镥-177或锕-225等α/β发射体实现精准“核辐射”。如抗HER2 Nbs-131I显著延长生存期，225Ac标记药物可诱导黑色素瘤消退并激活IFN-γ等细胞因子。此外，锝-99m等诊断性核素偶联物已进入中期临床，用于肿瘤精准分期。
・注：尽管NDC模块化设计优势显著，但小分子快代谢特性可能导致肾脏重吸收及潜在的肾毒性，连接子设计时需兼顾稳定性与可裂解性。
图2 NDc药物开发时应考虑的因素
3.2/协同增效：多特异性纳米抗体
肿瘤微环境涉及多细胞多分子的交互网络。双特异性及多特异性抗体可同时结合双靶点或双表位，其协同效应远超传统单抗。基于Nbs极易通过甘氨酸-丝氨酸接头进行基因融合的特性，构建多特异性Nbs不仅产量高、溶解度好，且设计灵活。
・双受体阻断型：同时抑制两条肿瘤代偿信号通路。
・T细胞重定向型：如靶向EGFR与Vγ9Vσ2 T细胞受体的双特异Nbs，能有效桥接并激活T细胞裂解EGFR阳性肿瘤。
・先天免疫激活型：如抗CD16与抗MUC-1双特异Nbs，通过激活PI3K/MAPK通路增强NK细胞对MUC1过表达肿瘤的杀伤。
・挑战与对策：bsNbs因分子量小易被肾脏快速清除（短半衰期）。目前多采用与抗白蛋白（HSA）或FcRn结合的抗体偶联，利用新生儿Fc受体循环机制延长血液滞留时间。
星耀小Tips：
作为国内微生物表达体系CRDMO先驱企业，耀海生物的纳米抗体技术平台具有多体系、广覆盖、多样性的全生态表达能力等特点，现有的表达系统包括：E.coli 原核表达系统、酵母表达系统（毕赤酵母），可熟练运用多种表达宿主菌，提供从菌株构建、多功能纳米抗体表达与纯化、大规模发酵生产的一站式纳米抗体研发生产制备服务。
3.3/深部渗透：基于纳米抗体的递送系统
纳米颗粒（NPs，<200nm）如脂质体、胶束、白蛋白基及聚合物纳米颗粒，是改善药物药代动力学的优良载体。Nbs因体积小且无Fc段，可高密度修饰于NPs表面，保护药物免受酶解，提升肿瘤局部浓度并降低免疫原反应。
・脂质体：仿细胞膜结构，偶联Nbs后已在结肠癌穿透及跨越脑内皮屏障抑制胶质母细胞瘤方面展现奇效。
・胶束：利用两亲性包裹疏水药物，如抗EGFR Nbs偶联胶束负载光敏剂mTHPC，实现光动力治疗中的长效循环与高效杀伤。
・聚合物与白蛋白NPs：聚合物支持基因与化疗药物共递送；白蛋白NPs具备极佳生物相容性，如抗HER2 Nbs修饰的HSA NPs共载光敏剂Ce6与过氧化氢酶，联合抗CTLA-4免疫检查点抑制剂，成功激活T细胞浸润并抑制卵巢癌转移。
图3 基于纳米抗体的药物递送系统概述
3.4/细胞工程化：Nbs-CAR细胞疗法
CAR-T疗法在血液瘤中大放异彩，但在实体瘤中因传统单链抗体片段的免疫原性及易聚集导致T细胞耗竭而受限。Nbs的高稳定与低免疫原性使其成为理想的新型CAR胞外结合域。
・Nbs-CAR-T：不仅靶向细胞表面抗原，最新策略通过结合HLA限制性肽表位，成功实现对细胞内肿瘤抗原的特异性识别。
・Nbs-CAR-NK：NK细胞兼具CAR靶向与天然受体识别双重优势，能清除MHC缺陷肿瘤且移植物抗宿主病（GVHD）风险极低。糖基化工程优化的抗CD38/EGFR Nbs-CAR-NK在骨髓瘤及实体瘤中展现出高效精准的杀伤力。
・Nbs-CAR-M（巨噬细胞）：通过强化吞噬功能突破实体瘤物理屏障。目前已有4款CAR-M获FDA批准临床，但基于Nbs的CAR-M仍属空白，潜力亟待挖掘。
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四、结语
实体瘤致密的间质高压、复杂的免疫抑制微环境犹如坚固的堡垒，极大限制了传统单抗的渗透与疗效。纳米抗体凭借其娇小的分子量、卓越的理化稳定性及强悍的穿透力，正成为击碎实体瘤壁垒的核心利器。从偶联药物的精准爆破，到纳米递送系统的长效蓄积，再到双特异抗体的协同激活与CAR细胞疗法的破局，Nbs已构建起多维立体的治疗矩阵。
全球首款双特异性纳米抗体药物的上市及Nbs-CAR-T在多发性骨髓瘤中的获批，标志着该技术已迈入成熟转化期。未来，融合肿瘤异质性特征的多靶点Nbs组合设计，结合智能递送与AI辅助全人源开发，必将为实体瘤的终极攻克提供更加精准、高效的多维解决方案。
