在原核与真核两大表达系统中，重组蛋白的生产均绕不开一个关键环节——菌种（细胞）建库。目前，针对真核细胞和原核细胞的细胞建库，其命名体系和整体构建流程在逻辑上是基本一致的，均遵循从RCB（Research Cell Bank，研究细胞库） 到MCB（Master Cell Bank，主细胞库），再到WCB（Working Cell Bank，工作细胞库） 的逐级放大路径。

然而，两者之间最核心的差异在于构建方式——这直接决定了实验路径、周期和工艺控制策略的不同。接下来，菌菌将重点围绕原核细胞建库的全流程展开详细解读，同时穿插与真核体系的对比，帮助大家建立清晰的认知框架。

一、原核细胞库构建的基本认知

在进行原核细胞库构建之前，首先需要明确细胞库构建的最终目的——无论是用于蛋白表达筛选、工艺开发，还是未来申报生产，这一目标将直接影响后续实验方案的设计。

确定目的后，第一步便是开展RCB菌株细胞的构建。RCB是整个细胞库体系的“源头”，其质量决定了后续MCB和WCB的天花板。因此，在RCB阶段，必须对菌株进行表达水平验证，全面考察其各项指标是否满足预设的质量标准，从而为后续MCB和WCB的建立奠定坚实基础。

细胞库系统通常由两个核心层级构成：

・主细胞库（MCB）：由含目的基因表达载体转化的细胞种子，经传代扩增后制备成均一悬液，定量分装于单独容器中用于长期贮存。MCB是细胞库体系的核心批次，所有工作细胞库均来源于此。

・工作细胞库（WCB）：从主细胞库中取出一支或多支，经有限传代扩增后制成的均一悬液，同样分装于单独容器中用于日常生产使用。

需要特别强调的是，所有贮藏容器均应在相同且受控的条件下妥善保管，一旦取出使用，不得再返回库内保存，以防交叉污染和冻融风险。

星耀小TIP：

应详细记录细胞库的类型、容量、预期使用频率下的寿命、保存容器、冻存剂配方、培养基信息、冷冻保存步骤及贮存条件等关键信息，并需提供库存细胞在拟贮存条件下的稳定性证据，这是合规性检查的重要一环。

二、原核细胞库的详细构建流程

在原核细胞库的构建中，RCB细胞库的构建是最为关键的环节，也是整个建库工作的技术起点。

2.1/法规对RCB的基本定位

法规层面要求“建立RCB需保证可溯源性”，同时对实验室阶段较为友好——GMP体系下生产对RCB来说为非必须条件。这意味着RCB构建可以在研发实验室完成，但需确保全过程记录完整、数据可追溯。

2.2/RCB构建的“三步走”流程

第一步：重组质粒的构建与验证。

首先将目标基因通过PCR实验进行扩增，再利用酶切连接技术将扩增产物构建至表达载体中，得到重组质粒。随后须经过酶切验证、PCR验证、测序验证，以及蛋白表达验证，在确认序列正确且蛋白表达无误后，方可认为质粒构建成功。（质粒构建流程图参见图1）

图1 质粒构建流程图

第二步：感受态细胞的制备。

在耀海生物公众号的相关文章《【菌周刊】大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备》和《【菌周刊】大肠杆菌Red同源重组敲除—感受态细胞的制备》中，均有具体实验流程可供参考。（参见图2）

图2 CaCl2法制备感受态细胞

星耀小TIP：

需特别留意的是，CaCl₂法所制备的大肠杆菌感受态细胞，对温度和保存时间极为敏感，转化率易受多重因素影响。实际操作中，新鲜制备的感受态细胞往往还需经过甘油处理、液氮速冻及超低温保存等复杂环节，这不仅增加了样品处理步骤，还须购置昂贵的超低温设备，既推高实验成本、延长操作周期，也可能引入转化污染的风险。因此，选择合适的感受态细胞制备方案与保存条件至关重要。

第三步：转化、筛选与RCB建库。

将验证正确的重组质粒与感受态细胞一同转化入宿主细胞（常用大肠杆菌）中。转化后，从原始菌株中筛选出优势菌株，制备宿主甘油菌。按一定比例接种于含抗生素的筛选培养基中，进行菌株筛选与扩增培养，常用方式为平板划线法。从中挑选长势良好的优势单菌落，进行甘油分装并保藏，通常建议建立50~100支菌株作为RCB细胞库。

建库完成后，须同步进行表达水平验证，确保RCB中的优势菌株在表达量、产物质量等方面均符合实验要求。得到的菌种液根据实验目的收集上清液或菌体沉淀——若目的产物分泌至上清液中，可使用AKTA层析系统，通过亲和层析、分子筛层析、离子交换层析等方式纯化获得目标样品并交付。（RCB菌株库流程图参见图3）

图3 RCB菌株库流程图

三、MCB与WCB的法规要求与操作规范

MCB和WCB的建立须严格参照《中国药典》2020年版三部相关要求执行：

・MCB：取RCB库中的菌种，通过规定方式传代增殖后，在特定倍增水平或传代水平同次均匀混合成一批，定量分装，保存于-60 ℃及以下的环境中。该批菌种须按特定质控要求进行全面检定，全部合格后方可作为主细胞库使用，并以此供应后续工作细胞库的建立。

・WCB：从主细胞库中取菌种传代增殖，达到一定代次水平后，合并制成一批均质细胞悬液，定量分装于安瓿或适宜的菌种冻存管中，在-60 °C及以下的甘油管中保存备用。

星耀小TIP：

依据《中国药典》2020年版三部规定，生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次，工作细胞库必须限定为一个细胞代次。同时，MCB和WCB的构建必须在GMP车间内完成，这是进入临床及商业化阶段的硬性门槛。

四、结语

回顾本次的核心内容：真核细胞与原核细胞的建库流程，其命名体系和逻辑框架高度一致，均遵循RCB→MCB→WCB的三级体系；核心差异在于构建方式——原核细胞主要依赖质粒DNA与感受态细胞的化学转化法导入宿主（常用大肠杆菌），而真核细胞则需通过转染、稳定整合及单克隆筛选等更为复杂的路径。

在原核细胞建库中，RCB建库是承上启下的重中之重，其菌株的稳定性与表达水平，直接决定了后续MCB和WCB的成败。无论是原核还是真核体系，严谨的建库策略、规范的记录溯源、严格的代次控制，始终是保证产品质量和合规性的基石。

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